Development of a Scalable Process for Lentiviral Vector Mass Production by Transient Transfection

Ansorge, Sven (2010) 

Thèse de doctorat, École Polytechnique de Montréal.

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Résumé

 Les vecteurs lentiviraux (LVs) sont considérés comme des véhicules de transfert prometteurs pour des applications en thérapie génique. Cependant, il y a un manque évident de stratégies de production efficaces et transposables à grande échelle. En effet, les techniques actuelles de production ne pourront pas suffire à la génération du nombre de LVs nécessaires pour les évaluations en phases cliniques et éventuellement pour leur commercialisation en cas de succès des essais. Dans ce travail, nous avons tout d’abord fait le point sur les méthodes actuelles de production des LVs et fait ressortir leurs contraintes intrinsèques. Jusqu’à ce jour, la production routinière de LVs se fait presqu’exclusivement à petite échelle avec des cellules adhérentes. Il est clair que ce mode de production ne sera pas suffisant pour répondre aux demandes futures en LVs. Afin de faciliter les essais cliniques et la production de LVs à des fins thérapeutiques après certification par les autorités de règlementation, il apparaît important de mettre au point de nouvelles stratégies de production à grande échelle et permettant l’obtention de vecteurs à hautes concentrations. Une technologie de production de LVs par transfection transitoire de cultures en suspension de la lignée cellulaire HEK293 a été développée. Dans ce procédé transposable à grande échelle, l’opération en mode perfusion a permis de résoudre la problématique associée à la faible stabilité fonctionnelle des LVs. La combinaison de plusieurs approches, incluant la transfection à haute densité cellulaire, la sélection de formulations avancées de milieux de culture et l’ajout de butyrate de sodium en tant qu’additif activateur d’expression, a permis d’augmenter significativement les productivités volumétriques et spécifiques. Ainsi, il a été possible d’augmenter de 100 fois le taux de LVs fonctionnels, que ce soit à petite ou à grande échelle, permettant d’atteindre des titres fonctionnels maximaux en LVs avoisinant les 108 unités de transduction (tu)/mL. Les cinétiques de production ont été évaluées en utilisant plusieurs méthodes de quantification des LVs. Ainsi, on a pu observer que les titres maximaux en LVs fonctionnels sont atteints deux jours après transfection. Ces résultats ont également démontré que la qualité des LVs produits (la qualité étant définie ici comme le rapport entre le nombre de LVs fonctionnels et le nombre de LVs totaux) était généralement faible : de l’ordre de 1 à 4 % du nombre de particules virales

ABSTRACT 

 Lentiviral vectors (LVs) are promising delivery vehicles for applications in gene therapy. Yet, the field still relies on inefficient and non-scalable production strategies. Current production methods will become a limitation in later clinical evaluation phases and for commercialization when large amounts of LVs need to be generated. In this work, we first reviewed current LV production methods and point out the constraints intrinsic to these protocols. To date, routine LV production is almost exclusively performed in small scale systems using adherent cells. These protocols will not be able to satisfy the anticipated future demands in LVs. For their widespread testing in clinical settings and for the production of LV-based therapeutics after their approval, novel scalable production strategies are needed to robustly produce these vectors at high yield. An optimized protocol for LV production was developed using a HEK293 cell line grown in suspension cultures. In this scalable process, production in perfusion mode addressed the low stability of functional LVs. Several strategies such as transfection at high cell density, selection of advanced medium formulations and addition of the expression-enhancing additive sodium butyrate resulted in significant improvements of volumetric and specific productivity. The overall yield in functional LVs was increased by 100-fold and similar results were obtained for small and bioreactor scale cultures, reaching maximum functional LV titers in the range of 108 transducing units (tu)/mL. The production kinetics under improved conditions was then analyzed employing several LV quantification methods. After transfection, highest functional LV titers were reproducibly found 2 days post-transfection. The results also showed that LV quality, as the ratio of functional to total LV particles was generally low with only 1-4 % of the total viral particles (measured as the number of viral genomes) being functional, i.e. having the ability to transfer genetic information. This ratio was not constant over time when sodium butyrate was added after transfection. LV quality was also increased at higher harvest rates. Our results also indicate that the cytotoxic effects of VSV-G might be limiting for further yield improvements of the current LV production system.

Type de document:	Mémoire ou thèse (Thèse de doctorat)
Département:	Département de génie chimique